Как учёные создали биосенсор для отслеживания липидов в живых клетках?
Менее 0,5 % всех мембранных липидов клетки — вот насколько мала доля сигнальной молекулы PI(3,5)P2. Этот фосфоинозитид управляет делением органелл, ответом на стресс и клеточным «самоперевариванием», но увидеть его в живых клетках не удавалось десятилетиями. Учёные Университета Осака, похоже, решили эту проблему навсегда.
Главная проблема — нечем смотреть
Диагностировать появление редких липидов в нужном месте и в нужное время до сих пор не позволяла чувствительность инструментов. Даже самые современные флуоресцентные зонды давали сигнал, едва различимый на фоне шума. Taki Nishimura, ведущий автор исследования, объясняет: исследователи просто не имели систематического способа создавать специфичные биосенсоры для липидов. Это было главным узким местом в изучении биологии мембран и их роли в болезнях.
Команда из Осаки пошла нестандартным путём: вместо того чтобы конструировать один идеальный зонд «с нуля», они запустили процесс ускоренной эволюции сенсоров прямо в лаборатории. Результат — метод, который получил название CLiB (cell surface liposome binding assay).
Эволюция на дрожжевой платформе
В основе CLiB лежат дрожжевые клетки, липосомы (микроскопические пузырьки из липидов) и флуоресцентный сигнал. На поверхности дрожжей экспрессируют тысячи вариантов потенциальных липид-связывающих белков. Затем клетки смешивают с липосомами, несущими конкретный липид-мишень, и сортируют по интенсивности флуоресценции. Те варианты, которые прилипают к липосомам сильнее, автоматически отбираются.
За несколько раундов такого отбора («эволюции») из библиотеки белков выделяется оптимальный сенсор. Как сообщается в статье, опубликованной в Nature Cell Biology, метод позволил за короткое время протестировать тысячи вариантов и найти те, что связываются с липидами с высокой специфичностью.
PX-SnxAGV: зонд для невидимки
Используя CLiB, учёные взяли существующий сенсор PI(3,5)P2 — домен PX из белка SnxAGV — и усовершенствовали его до версии PX-SnxAGV. Новый зонд оказался способен детектировать ничтожные количества липида, которые раньше просто терялись в фоне. И когда его ввели в живые клетки, открылась неожиданная картина.
Где прячется липид при стрессе
При резком повышении концентрации соли (осмотический стресс) PI(3,5)P2 не размазывается равномерно по мембране — он собирается в крошечные компактные участки, своего рода «горячие точки». Раньше увидеть это было невозможно. Ещё более интригующее поведение обнаружилось в процессе микроаутофагии.
В клетках млекопитающих лизосомы (клеточные «перерабатывающие заводы») при определённых условиях «заглатывают» повреждённые компоненты напрямую, впячивая собственную мембрану внутрь. Так вот, PI(3,5)P2 концентрируется именно в тех точках, где мембрана начинает втягиваться, готовясь принять груз. Это прямой намёк на то, что липид выступает молекулярным маркёром места будущего «заглатывания».
От рака до диабета
Проблемы с мембранными липидами лежат в основе множества заболеваний: рака, сахарного диабета 2-го типа, нейродегенеративных расстройств. Теперь, когда исследователи получили инструмент для наблюдения за липидами в реальном времени, открываются новые возможности для поиска лекарств.
«С нашими зондами мы можем видеть, когда и где липиды появляются внутри клеток. Это углубит понимание мембранных липидных сред и того, как они влияют на болезни», — объясняет Нисимура.
Метод CLiB не привязан к одному липиду. Его можно адаптировать для любых сигнальных молекул, стоит лишь заменить мишень на липосомах. Это делает технологию универсальной платформой для скрининга биосенсоров.
Впервые за долгие годы клеточные липиды перестают быть «серой зоной»; их перемещения и скопления становятся видимыми. Возможно, именно эта разработка ускорит создание лекарств, направленных на мембранные мишени. Что ещё скрывают крошечные липидные кластеры — и можно ли ими управлять? Ответ, вероятно, последует уже в ближайших работах с новым сенсором.
